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可调焦距透镜实现三维显微镜

时间:2024-09-18 来源:新特光电 访问量:1298

可调焦距的透镜可加速和增强多种现代显微镜方法(包括共聚焦、双光子和光片显微镜)的三维成像能力。

显微镜初学者可能会感到困惑,因为他们注意到样本中仅略微失焦的部分在图像中看起来往往要模糊得多。人眼看到的景深似乎比相机看到的景深大得多。这种令人困惑的效果之所以发生,是因为眼睛会适应:通过显微镜观察时,用户会不断(通常是无意识地)移动焦平面,而无需触摸调焦旋钮,只需将目镜调整到不同的焦距即可。因此,自从显微镜发明以来,可调透镜就帮助研究人员更直观地感受到微观物体的三维形状和纹理。在具有电子图像采集功能的现代显微镜中实现类似的装置是非常可取的。如今,科学家越来越需要在越来越短的时间尺度上以高空间分辨率对生物体的结构和功能进行成像。现代生物显微镜也正慢慢从对载玻片和盖玻片之间的扁平小样本进行成像转向 3D 细胞培养、整个胚胎甚至动物体内成像,以研究更自然的环境中的发展和生理学。

传统上,获取 3D 图像数据需要使用载物台或压电物镜 Z 扫描仪对物镜或样本进行机械平移。由于此类设备中活动部件的机械惯性,要实现数百微米 Z 范围 10 到 20 Hz 以上的体积扫描速率非常具有挑战性。

另一种称为“远程聚焦”的解决方案涉及改变光进入或离开显微镜物镜时的会聚度,以分别引起激发或发射焦点的轴向偏移。所有类型的可调光学元件都可以用于此目的:例如空间光调制器、可变形镜和可调焦距透镜。可调焦距透镜成本低、结构和控制简单、焦距调节范围广,特别适合要求以中等分辨率进行快速体积采样的显微镜应用。

可调焦距透镜技术

Optotune 的可变焦透镜采用弹性聚合物材料。透镜的核心元件由一个薄膜组成,该薄膜在充满液体的腔室和空气之间建立界面(图 1)。为了调整焦距,音圈致动器对围绕透镜通光孔径的液体容器施加压力。因此,液体被迫进入透镜的中心,从而改变膜的曲率。控制电可调透镜 (ETL) 很简单,只需要一个现成的电流控制器或透镜驱动器为透镜提供 0 至 290 mA 之间的电流。

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图 1. ( a、b ):电动可调镜头 (ETL) 的工作原理。电流控制的电磁或机械致动器向下推充满液体的镜头容器,迫使镜头液体进入镜头中心并改变其形状。( c ) 对于 ETL,我们提供了一个软件控制的镜头驱动器 ( d ),用于提供电流。( e ) ETL 的典型响应时间约为 5 毫秒。实际稳定时间随镜头光圈而变化。

有各种各样的 ETL 可供选择,其光圈范围从 6mm到 16mm。对于高色散镜头液体版本,典型的焦距范围为 52 至 120 mm,而对于低色散镜头液体版本,典型的焦距范围为 80 至 200mm。在工作过程中,控制电流会使镜头升温,导致温度相关的焦点漂移。由于液体镜头的热焦距膨胀比玻璃镜头的热焦距膨胀大约大两个数量级,因此镜头需要集成温度传感器。结合靠近液体的温度传感器以及镜头上校准曲线的存储,USB 驱动程序固件可以计算出正确的电流值,以设置和维持镜头在给定的焦距。ETL的一大优势是响应时间短,只有几毫秒。图 1e 显示了响应矩形阶跃脉冲时归一化屈光度随时间变化的典型示例。可调透镜在 240 至 2500 nm 范围内具有较大的透射率和较高的损伤阈值(1064 nm 连续波操作下的损伤阈值为 10 kW/cm2),并且具有保偏功能。

将可调透镜集成到显微镜中

现代显微镜使用无限远校正物镜,这意味着源自样品的光会以平行光束的形式从物镜中射出。要创建图像,需要一个额外的筒镜(图 2)。相反,通过将准直激光束发送到物镜中,激光会集中到样品内部的焦点上。使用可调透镜改变光束的准直状态会移动焦平面。例如,当将发散光束发送到物镜时,焦点会移离其前透镜。

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图 2. ( a ) 在具有无限远校正光学系统的显微镜中,图像由物镜和筒镜形成。( b ) 通过在物镜和筒镜之间插入由两个消色差透镜组成的附加中继系统,形成共轭光瞳。ETL 和偏置透镜可以放置在此位置以进行轴向聚焦,而无需改变数值孔径或放大倍数。水平放置 ETL 和偏置透镜可避免重力引起的透镜膜变形。

对于大多数 3D 显微镜应用,需要能够增加和减少物镜的工作距离。一些 ETL 仅限于在正焦距极限之间进行调整。在这种情况下,需要将它们与固定负偏移透镜 (OL) 配对,以将光束从会聚变为发散。当通过显微镜的目镜观察时,人类观察者会移动头部,直到他们的眼睛位于显微镜的出瞳处,通常可见为似乎悬停在目镜上方的小亮盘。当放置在出瞳处时,眼睛可以最好地概览微观图像,并且作为“集成”的人类聚焦装置发挥最佳作用。理想情况下,ETL/OL 组合也放置在这样的瞳孔位置,但使用标准目镜的出瞳通常没有好处:典型的筒透镜和目镜组合的高中置放大倍数极大地限制了可用的聚焦范围。这是因为调整范围与显微镜放大倍数的平方成反比。更好的选择是使用定制的中继系统创建与显微镜物镜共轭的瞳孔位置(图 2)。需要小心地将 ETL/OL 组件放置在光路的垂直部分(图 2b)。否则,由于重力引起的透镜膜变形,图像可能会出现不必要的像差(尤其是彗形像差)。在具有高度模块化设计的新一代研究显微镜中,集成这种中继系统通常很简单。尽管如此,一些商用仪器不应该由用户进行大量修改。在这种情况下,ETL/OL 组合可以放置在平行光束路径上的其他位置。缺点是将可调元件放置在远离共轭瞳孔的位置会导致聚焦时放大倍数和数值孔径 (NA) 发生变化。用光学设计术语来说,该系统不再是远心的。因此,焦距偏移伴随着变焦效果和分辨率变化。对于小的调谐范围 - 几十分之一微米 - 这些影响通常非常小且可以容忍。对于较大的焦点位移,可以通过图像处理来补偿放大倍数的变化。

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图 3.使用 40 倍物镜和集成在转盘共聚焦显微镜中的 ETL 拍摄的花粉粒(直径 100 μm)的 Z 轴堆叠图。图中显示了不同轴向焦点位置的单帧图像和最大强度投影。最大 Z 轴范围为 60μm。

在远程聚焦系统的设计中,成本和复杂性之间存在着重要的权衡。与可变形镜或空间光调制器不同,大多数可调透镜只有一个自由度,即焦距。在远程聚焦路径中配备单个 ETL 的显微镜无法像真正的自适应光学显微镜那样在 Z 调谐范围内执行同样复杂的像差校正。但是,使用 ETL 聚焦的成本仅为成熟自适应光学装置成本的一小部分。

应用示例:共聚焦显微镜

共聚焦显微镜是最重要的显微镜技术之一,它在细胞生物学、单分子物理学和许多其他学科中有着广泛的应用。我们测试了 ETL 与连接到倒置显微镜支架(Olympus IX71)的商用转盘共聚焦显微镜模块(Yokogawa CSU-X1)的组合。

由于无法在该显微镜中集成中继系统,因此将 ETL/OL 组件安装在可旋转到光路中的定制滤光块中。使用 40 倍物镜和 1.3 NA(Olympus UPLFLN 40XO),最大 Z 范围达到 60 µm。

应用示例:体内双光子显微镜

由于在散射介质中具有出色的成像能力,双光子激发是一种非常适合对脑组织深处进行荧光成像的技术。结合神经元活动的功能指标和体内成像协议,双光子显微镜是一种标准方法,用于记录活体小鼠脑内数百微米深处的十分之一到数百个神经元的群体活动。

对单个焦平面的采样只能提供局部网络中分布活动模式的一瞥。因此,我们修改了现有的双光子显微镜,该显微镜能够使用带有 ETL 和 OL 的声光偏转器进行非常快速的 X/Y 扫描。1声光偏转器可以以千赫兹的速率以随机访问模式快速将飞秒激光束瞄准大量神经元。

添加 ETL 可以快速瞄准多个焦平面。我们实现了 30 到 40 Hz 的成像速率,最多可对 40 个神经元进行成像,这些神经元分布在相距 30 到 100 µm 的两个平面上(图 4)。除了多平面成像外,ETL 还可用于对清醒和行为动物进行运动校正。

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图 4. ( a ) 物镜支架,用于将 ETL 集成到带有声光偏转器的定制双光子显微镜中,以便对小鼠大脑中的神经元活动进行体内成像。ETL 由电流控制器 (CC) 驱动,并与偏置透镜(未显示)组合安装在靠近物镜的位置。( b ) 由于 ETL 未放置在共轭瞳孔位置,因此扫描体积呈锥形。声光偏转显微镜可以使用钙指示剂以随机访问扫描模式快速测量神经元活动。ETL 增加了以高达 40 Hz 的速率对多个平面进行成像的能力。( c ) 这些图像显示了不同深度的两个平面(神经元显示为灰色,星形胶质细胞显示为橙色)。选择用于快速钙成像的细胞(1 到 40)已标记。神经元信号表现出对施加在动物胡须上的重复气流的刺激锁定反应。比例尺:20 µm。

应用示例:快速3D光片显微镜

在过去十年中,光片显微镜和选择性平面照明显微镜 (SPIM) 已被公认为生物样本体内成像的理想工具(例如,用于记录斑马鱼和果蝇的胚胎发育)。在 SPIM 中,样品从侧面用光片照射,以将荧光激发限制在显微镜物镜焦点的单个平面上。SPIM 提供出色的光学切片、低光毒性和高图像采集速度,并被《自然方法》评为 2014年度方法。

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图 5.使用配备 ETL 的快速 Z 扫描 (ETL-SPIM) 光片显微镜以 60 Hz 体积速率对跳动的斑马鱼心脏进行 3D 重建。心脏标记为蓝色;红细胞显示为红色。

最近,SPIM 装置配备了 ETL,可进行快速体积扫描。使用以每秒数百到数千帧的速度运行的相机,可以以每秒 30 到 60 次体积扫描的空前速度获取跳动斑马鱼心脏内的 10 到 20 个平面。4如此高的体积率可以追踪流经跳动心脏的单个红细胞。

未来

未来,将提供具有更大通光孔径和调谐范围的 ETL,以及可使重复性提高一个数量级的创新驱动电子设备。还可以想象,带有集成可调镜头的显微镜物镜将在未来十年内投入常规使用。

认识作者

Fabian F. Voigt 是瑞士苏黎世大学脑研究所的博士生

致谢

作者感谢 Manuel Aschwanden、Jerry Chen、Adriana Dabacan、Helge Ewers、Florian Fahrbach、Benjamin Grewe、Fritjof Helmchen、Jan Huisken、Michaela Mickoleit、Oliver Pfäffli 和 Mark Ventura 为实现基于 ETL 的快速 3-D 显微镜所做的贡献。

参考文献

  1. B. Grewe 等人 (2011)。使用电动可调焦距透镜对神经元细胞群进行快速双层双光子成像。Biomed Opt Express,第 2035-2043 页。

  2. J. Chen 等人 (2013)。使用可调焦透镜进行双光子成像期间在线校正舔舐引起的大脑运动。J Physiol,第 4689-4698 页。

  3. EHK Stelzer (2015)。用于定量生物学的光片荧光显微镜。Nat Methods,第 12 卷,第 1 期,第 23-26 页。4

  4. F. Fahrbach 等人(2013 年)。带可调透镜的快速 3-D 光片显微镜。Opt Express,第 21010-21026 页。5

  5. M. Mickoleit 等人(2014 年)。高分辨率重建跳动的斑马鱼心脏。Nat Methods,第 11 卷,第 9 期,第 919-922 页。

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