用于宽视场、共焦、双光子和检测显微镜的可调焦距镜头

概述

可调焦距镜头EL-10-30 具有大光圈、快速响应和启动时间以及良好的光学质量等特点，为显微镜的各种应用提供了广阔的前景。在本应用说明中，我们讨论了电动可调透镜 (ETL) 在三种不同显微镜方法中用于快速轴向聚焦的实施情况：(1) 经典宽场荧光显微镜，(2) 荧光共聚焦显微镜和 (3) 双光子显微镜。

一般考虑因素和典型应用

电动可调焦距透镜可用于显微镜的不同应用。其中包括专门的可调照明系统以及电控变焦光学系统等。在本应用说明中，我们只讨论电动可调焦距透镜在沿光轴聚焦方面的应用。根据电动可调焦距透镜的实现方式和光学性能要求，可以实现30-700μm的轴向聚焦范围。不过，在显微镜中使用电动可调透镜所讨论的大多数技术细节也适用于其他应用。在标准显微镜中，轴向聚焦通常是通过移动 Z 平台上的试样或显微镜物镜来实现的。精确聚焦的常见替代解决方案是使用压电驱动物镜支架。然而，这些聚焦技术都是基于相对于标本的机械轴向移动。如果使用光学聚焦方案，则可以实现无运动、甚至更快的聚焦。 在显微镜的光学通路中加入电动可调焦距透镜是实现光学聚焦的便捷解决方案。现代显微镜物镜采用无穷远校正光学系统，这意味着从物镜焦平面内某一点发出的光不会聚焦到像平面内的某一点，而是作为一束平行光束（聚焦到无穷远）从物镜中射出（图 1）。要在检测器上形成真实图像，还需要额外的管状透镜。

图 1：无限远校正物镜在成像过程中将平行光束聚焦到焦平面上的光点，反之亦然。 位于标称焦平面下方或上方的点光源会分别产生会聚光束或发散光束。

如果将物体或光源移近物镜前透镜，物镜会产生发散光束，而将物体放置在比标称工作距离更远的地方则会产生会聚光束。这些条件也可以反过来考虑： 如果可以使用可调光学元件在物镜上产生发散光束或会聚光束，显微镜就可以沿光轴聚焦。这既适用于照明，也适用于通过物镜的成像光路，如激光扫描显微镜。

由于液态镜头EL-10-30 只能产生可调谐的会聚光束，因此必须搭配负焦距的偏置透镜，才能实现从负焦距到正焦距的调谐范围（图 2）。我们将焦距为 -100mm的平凹单透镜与 液态镜头EL-10-30（低色散变体，焦距范围为50-200mm）组合在一起。电动可调焦距透镜和偏置透镜 (OL) 的组合可安装在定制透镜架或标准 30 mm透镜管中。

图 2：EL-10-30 (电动可调透镜) 和负焦距偏置透镜 (OL) 的 ZEMAX 模型（f= 100mm，Thorlabs LC4232）。请注意可调表面曲率的变化以及由此产生的光束发散变化。

实现光学聚焦的最简单方法是将 ETL/OL 组件尽可能靠近物镜安装（图 3）。例如，可以将 ETL 和 OL 安装在带有两个有效值螺纹的镜筒中，并插入物镜转舌器和物镜之间，这与插入压电聚焦装置的方式相同。

图 3：ETL/OL组件与显微镜物镜相结合（USP 4231637）。整个系统的轴向长度约为50mm。在该系统中，EL-10-30的焦距从150mm移动到80mm，会导致轴向焦距在标称工作距离周围发生-50 μm到 +50μm的移动。物镜焦距为4.4 mm。

将 ETL 和 OL 放置在靠近物镜后挡板的位置既直接又简单，但这并不是光学聚焦的最佳位置，也不适合所有成像应用。大多数显微镜物镜都是远心的，这意味着每束射线中的中心射线（如图 3 中红色的轴上射线），也称为主射线，在离开物镜前透镜后沿光轴传播。将 ETL 放在靠近物镜的位置进行聚焦会导致非远心条件（图 4）。其结果是，如果轴向聚焦位置发生变化，视场（FOV）大小或放大倍率也会发生变化。如果所需的焦点偏移很小（< 50μm），则可以忍受。另外，ETL/OL 组件也可以通过 4f 中继系统（例如由两个消色差组成的 4f 系统）定位在显微物镜的共轭瞳孔平面上，因为大多数物镜都有一个无法触及的挡板（图 5）。

图 4：显微镜物镜前透镜上的两条射线束在样品的不同侧向点聚焦。左图显示了远心条件下的两条射线束--中央绿色（主射线）平行于光轴传播（蓝色主射线）。中间和右图显示的是使用同一物镜聚焦，ETL/OL 靠近其后挡板的情况。斜（红色）射线束的主射线并不平行于光轴传播，因此，如果焦平面移动到更靠近物镜的位置（导致放大倍率或 FOV 大小改变），红色和蓝色焦点之间的距离就会增加。

图 5：保持远心成像条件的 4f 中继系统布局示例。ETL/OL 组件（左侧）通过中间部分由两个 f=100mm消色差组成的 4f 系统放置在物镜（日本专利 8-292374；右侧）的共轭瞳孔平面上。瞳孔（红光束和蓝光束的交点）被重新成像到物镜中。该系统的总长度约为 380 mm。要生成图像，系统左侧需要一个管状透镜。在基于 ETL 的聚焦过程中，中间焦平面会发生移动。

不过，大多数商用显微镜不允许将中继系统插入光路。在这种情况下，将中继系统置于相机或激光端口可能是一种选择。

电动可调焦距镜头EL-10-30 的控制方式

通过使用激光二极管的精密恒流驱动器（例如 Edmund Optics NT56-804、Thorlabs LD1255R）和 0-250 mA可编程模拟输出，可以轻松实现对 EL-10-30 的计算机控制。对于简单的聚焦应用，只需将控制电流与聚焦位置相关联的校准查找表即可（请参见图 15）。

两种实施方式概述如下：

应用实例： 宽视场显微镜

就视觉使用而言，聚焦时视场角或放大倍率的变化会造成混淆（因为其视觉外观相当于变焦效果）。如果对焦增量较小（几微米），这种情况还可以忍受，否则就会造成干扰。在这种情况下，有必要将 ETL/OL 组件置于共轭瞳孔位置。在大多数显微镜中，必须在光路中插入一个定制模块，其中包含附加的中继光学元件和 ETL/OL 组件。在典型的直立式显微镜中，停止位置位于物镜内部，无法触及，因此必须使用中继系统。然而，在倒置显微镜中，显微镜机身内部的光学元件通常会形成一个共轭瞳孔，在某些类型的显微镜中，这个瞳孔是可触及的，并且位于光路的垂直部分，因此非常适合插入基于 ETL 的聚焦系统。20 世纪 80 年代的蔡司 Axiovert 35 就是这样一款显微镜，如图 6 所示。

安装

通过将 ETL/OL 组件插入 30 mm的镜筒，并将其固定在光学导轨上（图 8），使其靠近瞳孔。为了定位瞳孔位置，可以使用一个简单的技巧： 将用于相位显微镜的相位掩膜重新成像到共轭瞳孔平面。在聚光镜或物镜中形成相位掩膜清晰图像的位置就是 ETL 的理想位置（图 8 中的插图）。这种基于 ETL 的聚焦方式还有一个优点，即 ETL 可用于多种物镜。根据物镜的不同，ETL 和 OL 的最佳位置可能会有所偏移，因为某些类型的物镜在瞳孔成像特性上有所不同。

图 6：Axiovert 35 显微镜的光路。ETL/OL 组件可放置在瞳孔处，无需插入额外的中继系统。TL：管状透镜。

图 7：Axiovert 35 显微镜，取下侧盖可进入瞳孔。图 6 中显示的部分光学元件突出显示。

图 8：在共轭瞳孔位置插入 ETL/OL 组件。ETL 和 OL 安装在连接到光学导轨的支柱上。插图： 共轭瞳孔位置可通过寻找相位环的清晰图像来确定。

结果

结合使用 40x NA 0.6 物镜（Zeiss LD Achroplan 40x / 0.6 Korr Ph2），可实现最大 120μm的散焦范围（校正环设置在固定位置）。图 9 显示了用 ETL 聚焦采集到的一组花粉粒的 Z 叠图像示例（表荧光模式）。

图 9：通过一组花粉粒进行基于 ETL 的聚焦。相对于标称图像平面，图像范围从 -30μm到 + 25μm。由于 ETL 位于共轭瞳孔处，因此放大倍数没有变化。比例尺：100μm。

应用示例 共聚焦显微镜

共聚焦显微技术是最重要的显微技术之一，在细胞生物学、单分子物理学和许多其他领域有着广泛的应
用。

安装

标准共聚焦显微镜是高度集成的系统，无法访问或插入光路中的大部分光学元件。根据具体的显微镜，可以采用不同的解决方案插入 ETL/OL 组件。一种方法是，如果共焦成像不需要滤光器立方体，则将 ETL/OL 组件安装在显微镜支架滤光器转塔中的定制滤光器立方体中。另外，也可以将 ETL 安装在中继系统中（图 10）。

我们使用的显微镜1（图 11）是一台旋转盘共焦仪，共焦单元（横河 CSU X1）和 CCD 摄像机连接到奥林巴斯 IX-71 的侧端口。这种显微镜配置允许将包含 ETL 和 OL 的改装原始滤光片盒插入滤光片转塔，而无需对显微镜进行大量改装。在操作过程中，只需将滤光片转塔旋转到空位，即可将 ETL 从光路中移除。

图 10：在典型的倒置激光扫描显微镜中实现基于 ETL 的聚焦的三种不同方案。(1) ETL/OL 可以像压电式聚焦装置一样放置在显微镜物镜和物镜转塔之间。(2) 如果可能，可将 ETL 和 OL安装在定制的滤光片立方体中。这两种方法都有一个共同的缺点，即在聚焦过程中放大倍率可能会发生显著变化。(3) 为了避免这种情况，可以在共焦扫描装置和显微镜支架之间插入一个中继系统。为使系统达到最佳性能，ETL 应位于光路的垂直部分，否则，由重力引起的可调谐膜的不对称变形可能会导致图像质量下降。

图 11：在共聚焦显微镜中实现 ETL 和 OL。(a) 旋转盘装置安装在显微镜支架的左侧端口。蓝色 CCD 相机用于成像。驱动 ETL 的电流转换器由函数发生器控制。ETL/OL 组件安装在定制的滤光器立方体 (b) 中，并插入滤光器转塔 (c)。滤镜转塔重新插入显微镜支架，就在物镜转塔的下方。

结果

结合使用 40x NA 1.3 物镜（奥林巴斯 UPLFLN 40XO），可以实现 60μm的 z 范围。图 12 显示了花粉粒（直径 100 μm）z-stack 的单张切片。

图 12：花粉粒（直径 100μm）的 Z 叠图，范围为 60μm。图中标出了相对于第一幅图像的 Z 位置。比例尺： 50μm。

图 13：图 9 所示数据的最大强度投影。

应用实例： 双光子显微镜

双光子激发技术在散射介质中具有出色的成像能力，因此非常适合在组织深处进行荧光成像。结合神经元活动的功能指标和活体成像方案，双光子显微镜是记录活体小鼠大脑深处十分之一到数百个神经元群体活动的标准方法。神经元分布在整个体积中，对单个焦平面进行取样只能提供局部网络中整个活动的提示。因此，我们需要快速、简单的三维显微镜技术，而 ETLs 的使用提供了一种非常简单直接的方法。事实上，ETLs和双光子显微镜是一种理想的组合，主要体现在以下几个方面：

• 在大多数双光子显微镜中，只需在激发路径上实施光学聚焦方案即可实现轴向扫描。这是由于双光子显微镜采用了非线性激发过程，只能在焦点处激发荧光团。通过改变激发光束来沿轴向和横向移动焦点，就足以实现三维双光子激光扫描显微镜。

• 激发激光的波长为近红外波长，在我们的显微镜中为 850nm。长波长可容忍在可见光波长下会严重降低图像质量的波前像差。

• 激发激光的光谱带宽较小（10 nm FWHM），这限制了非色差 ETL/OL 组合可能带来的色差影响。

• 对于大多数测量功能细胞活动的生物应用而言，安装在物镜附近的 ETL/OL 组件所带来的视场尺寸变化不会干扰测量。要记录功能数据，激光必须在一段时间内反复对准同一组细胞。如果由于放大倍率的变化，细胞之间的距离变远，则会选择相应的点进行扫描。

安装

与定制的双光子显微镜结合使用的装置如图 14 所示。

图 14：ETL/OL 组件在双光子显微镜中的应用。(a) ETL 和 OL 安装在一个定制的物镜架上，物镜架连接到显微镜的检测系统上。利用可移动的二色性 DC，可将发射的荧光引导至背景中的检测系统。物镜架底部有一个 RMS 螺纹，可安装奥林巴斯 LUMPlanFl/IR 40x NA 0.8 水浸物镜。(b) 安装在定制支架内的 ETL 和 OL的剖面图。(c) 直接观察荧光素溶液中的双光子激发焦点。结合 40 倍物镜，焦点（绿色细长光斑）的移动范围可达 700 μm。

结果

通过在 50 至 200mm之间调整 ETL 的焦距，可以实现高达 700μm的轴向聚焦。物镜的工作距离（名义上为 3.3 mm）相应地从 2.8mm变为 3.41mm。对于大多数成像应用来说，更小的范围就足够了。

图 15：轴向焦距偏移（40 倍物镜，-100mm偏置透镜）与 ETL 控制电流的关系。这组校准值被用作查找表，以便对焦到所需位置。

图 16：用显微镜电动 Z 平台测量的花粉粒在不同轴向焦距位移下未经 ETL 重新聚焦（左图）和经 ETL 重新聚焦后的图像。请注意放大倍率/视场大小的变化。刻度线： 5μm。

应用实例： 检测显微镜

在使用标准镜头组件的检测显微镜中，可调谐镜头通常位于无穷远校正物镜和管状镜头之间。下面的示例概述了将 EL-10-30-Ci 与 Qioptiq 的 Optem 微型检测镜头相结合的现成系统。所有部件都有 C 型安装螺纹，因此可以完美配合。下表概述了实现的 Z 范围和分辨率。

图 17：使用现成组件的高倍率检测系统示例。图中显示的是放大 7.9 倍的印刷电路板（轨迹宽度为 10μm）

在显微镜中使用电动可调透镜

• 在光束路径的哪个位置插入 ETL/OL 组件？是否可以到达这个位置？

• 是否可以将 ETL/OL 组件垂直放置在光路内的地面上，以避免电动可调透镜表面因重力而出现任何不对称形状？

• 光束是否足够小，以匹配 EL-10-30 的 10mm孔径？（这也适用于共轭瞳孔的大小。）如果不需要电动聚焦，请考虑使用手动可调镜头 ML-20-35，其自由孔径为 20mm。

• 您需要达到哪个聚焦范围？在大多数情况下，使用电动可调透镜的光学聚焦需要辅以机械聚焦装置，才能达到所需的范围。电动可调透镜非常适合使用中高 NA 物镜实现从十分之一到数百微米的聚焦范围。使用低倍率、低净空系数（NA）物镜，聚焦范围似乎可以达到 1mm。

• 必须满足哪些光学性能要求？例如，在双光子显微镜中，准单色的近红外激发光可以降低对色差和其他像差的校正要求，从而获得数百微米的聚焦范围，这正是活体大脑成像所需要的。另一面，典型的共聚焦显微镜在光学校正方面的要求要高得多，但典型的样本尺寸也要小得多（十分之一微米），这使得 ETLs能够成功应用于某些应用。对整个显微镜进行光学模拟，通常可以使电动可调透镜介导的聚焦符合必要的要求。

• 目标对焦速度是多少？EL-10-30 的快速对焦已得到证实（使用 40x NA 0.8 物镜，15ms内对焦移动100 μm，相当于焦距从 108 mm变为 82mm）。