声光可调谐滤波器如何增强共聚焦显微镜的多功能性

共聚焦显微镜，又称共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），已在生命科学领域应用数十年。从眼科到神经科学，共聚焦显微镜为拯救生命的诊断、治疗和研究提供了支持。声光可调谐滤波器（AOTF）可为共聚焦显微镜提供更清晰的图像、逐像素的波长灵活性和精确控制。G &H 生命科学副总裁Lars Sandström探讨了这项技术如何发展以进一步增强共聚焦显微镜在生命科学领域的通用性。

从滤光片转轮到声光可调滤光器（AOTF）

共聚焦显微镜中荧光的激发光源是激光或不同颜色的激光组合。出于技术原因共聚焦选择激光作为光源。但是传统激光器通常只发射一条或几条单一波长的激光谱线（现代化解决方案是白光激光器）。然而，生物医学成像所使用的荧光染料的激发光谱从近紫外到近红外的都有。大多数情况下，为了同时检测几种不同荧光染料的发射情况，需要通过二向色镜结合一系列激光谱线来实现。在这种情况下，与在荧光照明中分离激发和发射光的“分光镜”相比，反射镜以反向模式使用。由于通常激光器的低频噪声频带相对较窄，因此不建议直接通过激光功率控制强度。因此，需要一种设备来单独减弱激光强度。同样，如果关闭和打开光源次数过多，激光器寿命也会缩短。特别是气体激光器，在关闭后仍处于高温状态而未冷却时，不适合马上再次开启。

“激光电池”满足以上所有要求，它由一系列激光器（通常为3-5个）组成。所有激光器均配有光闸，光闸由机电驱动并由软件控制。所有激光器都需要一个用于减弱强度的伺服控制设备（一个带有一系列灰度滤片滤光片转轮或滑块）多谱线激光器还需要另一个滤光片转轮或滑块，它包含一系列边缘滤片和带通滤片，以便选择单谱线或组合谱线。显然，整个设置可能会变得略微复杂低效，容易出现错位和漂移问题，可能在滤片选择切换过程中引发机械振动。若改变激发方案，成像的效率将非常低下，由于安装在滤光轮或滑块上的滤光片数量有限，该设备灵活度不高。

荧光的激发需要特定颜色的光：既要有效地激发探针（波长接近探针激发光谱的最大值），又要留下足够的空间收集发射光而不会进入检测器的光路中。在共聚焦显微镜中，通常使用多谱线激光器或激光电池作为激发光源，这需要设备既能够自由选择适合当前实验所用荧光团的激发谱线又能够控制该激发谱线的强度因为直接在光源处控制强度时，大多数激光器会出现噪音增强的现象。声光可调谐滤波器（AOTF）的引入简化了滤光过程，同时显着提高了实验的灵活性。声光可调谐滤波器（AOTF）对于耦合白激光源是唯一的明智选择。

传统的“激光电池”带有5个激光管、5个机械光闸、8个光束组合镜、5个衰减滤光片转轮和1个用于多参数共聚焦显微镜的选择激发谱线滤光片转轮。

如今，共聚焦显微镜的生物医学应用越来越依赖于声光可调谐滤波器（AOTF）。AOTF技术带来的精确控制、灵活性和速度提升了共聚焦显微镜的多功能性，进而推动了科学创新。随着对更高图像清晰度和灵活性的需求不断增长，AOTF解决方案也可能变得更加复杂，需要特定的综合专业知识和能力。

声光可调谐滤波器（AOTF）运行方式

简化机械设置并将灵活性提高几个数量级的一个重要步骤是采用声光可调滤光器（AOTF）。AOTF是一种可以控制所需颜色的光指向一个不同的方向的设备，而其余颜色的光直接通过 AOTF。AOTF由晶体制成，通常是TeO2或SiO2或其他具有类似特性的化合物。晶体由机械转换器在几百兆赫范围内的机械波激发（声光可调滤光器的“声”是指机械波，尽管频率不符合人耳可听见声音的频率）。最重要的是所需光束偏转的方向是固定的，不会随光的颜色而改变。此外，指定方向的进光量也可以通过机械波的振幅进行控制。

激光电池发射出不同波长的激光谱线（准直）后，AOTF可以选择任意波长的谱线使之偏转至所需方向，并可控制该谱线的能量。AOTF可以真正同时选择多条谱线，谱线数量主要取决于采购设备具体情况。一个好的系统可同时提供8条谱线。AOTF用机械固定的单晶完全取代了上述所有快门、衰减滤片和谱线选择滤片，可以轻松实现任意谱线的组合；当激光电池同时提供8条谱线时，组合方式达到256种——这对于AOTF来说不是问题。另外：每条选定的谱线在强度上都是无级可控的。本质上，AOTF是一个“8通道激光调光器”。工程师可能会认为，AOTF将两种偏振模式导向不同的方向。这是完全正确的，并不损害概念。无论如何，激光都是偏振光，因此光将始终指向既定方向。垂直方向无激光，没有任何指向。

在以传统激光电池为光源的共聚焦照明中，AOTF（右边的方框）替换了所有快门、衰减滤片和谱线选择滤片，任何进入AOTF的谱线都可以得到抑制、衰减或完全用于共聚焦显微镜。由激光器发射的任意谱线都可进行组合（组合数量大但有限）。

AOTF在共聚焦显微镜中的应用和优势

声光分束器可在特定样本中进行任一符合荧光染料组成的激光组合。除此以外，假设用两种不同的荧光染料对标本进行染色，一种非常强，另一种非常弱，而无级调谐通过调暗明亮染料的激发来检测强度相似的两种荧光，可以平衡荧光发射强度。因为AOTF的控制速度很快，不需要停止扫描过程，所以很容易在成像过程中即时实现，通过无级控制来平衡激发光强度，不仅有利于对比荧光通道，而且还是改善荧光染料光谱拆分的利器。许多染料的发射光谱出现“拖尾”现象，导致在成像的通道收集了错误的信号。通过将激发降至最低，可以改善发射光谱的拆分（抑制串色）。

用不同激光谱线或不同强度的同一条激光谱线扫描感兴趣的区域。在激光谱线扫描期间，照明方式会根据预定义的模式在预设点发生变化。任何组合都是可能的，几乎所有图形都可以使用鼠标在预扫描的图像上绘制。当然，也可应用几何图案（矩形、圆形、椭圆形……）。“零线”也是一种模式，常用于保护细胞培养物中的背景细胞。

最后，选定谱线的波长（和强度）之间的切换在几微秒内完成，速度非常快；相比之下，机械标准滤光片转轮大约需要一秒钟。这种快速切换使得在单条谱线的扫描期间可以改变激发方式（采用何种波长的谱线，这些谱线分别对应多大强度）。此功能可在样本上绘制用不同激发光激发的区域，即所谓的“感兴趣区域”，在这些区域中，不同的激光被激活用于成像。此外，无需采集信号的区域不会被照射，非常好地保护了样本以供日后研究。下图展示了这类感兴趣区域，在单次扫描中应用了5种不同的参数设置。如果选择白光激光器作为光源，AOTF可以选择白激光中任何可用的颜色。在此情况下，声光可调谐滤波器（AOTF）将白激光光源变成可调光源。

声光 (AO) 元件在共聚焦显微镜中有着广泛的应用，例如调制、功率控制、激光开关、激光耦合和分束。在单个扫描头中，例如徕卡显微系统的STELLARIS 8，如下图。

STELLARIS 8 扫描头（图片由徕卡显微系统公司提供）

声光元件得到了广泛应用。特别是声光可调谐滤波器 (AOTF)，它表现出色，具有诸多优势，包括：

更清晰的图像

活体组织检测的一大挑战在于如何在不造成样本移动、分子变化或损伤的情况下快速获取多光谱数据。声光可调谐滤波器（AOTF）的多功能性使其能够分析活细胞。这意味着，借助基于声光可调谐滤波器（AOTF）的系统所具备的快速强度和波长切换能力，科学家可以监测动态细胞过程。由于这种快速强度和波长切换能力，研究人员现在可以精确地监测完整的动态细胞过程。荧光漂白后恢复（FRAP）、荧光漂白损失（FLIP）以及用户自定义的小样本区域（感兴趣区域，ROI）等技术已取得了显著进展。

逐像素波长和功率控制

显微镜操作员可以保持高扫描速率，同时逐像素地调整图像。通过为每个波长和激光器分配不同的强度，可以实现不同信号强度的平衡。声光可调谐滤波器 (AOTF) 的一个用途是选择激发波长并设置白光激光器的功率。高级激光复用方案是声光可调谐滤波器（AOTF）通过选择系统中的激光源并控制其强度来控制波长和强度。声光技术可以快速、精确地控制透射率和波长选择。然后，声光可调谐滤波器（AOTF）可用作激发滤波器，并且可以“实时”调整。这与传统的介质带通滤波器形成鲜明对比，后者任何调整都意味着需要购买新的滤波器。此外，显微镜中可安装的滤波器数量始终存在限制。

环境稳定性

共焦系统中的声光可调谐滤波器（AOTF）能够实现对多条激光线的灵活、快速的电子调谐和强度控制，从而消除温度或湿度变化引起的任何潜在频率漂移。而使用滤光片转盘/转轮的机械调谐方案则很难实现这一点。

技术规格

声光可调滤波器(AOTF)用于快速和动态地从宽带或多线激光源中选择特定波长。当施加射频频率变化时，传输的波长就会改变，在数十微秒或更短的情况下调整光束或图像的波长。典型应用领域包括共聚焦显微镜、荧光成像、高光谱成像、成像光谱、激光波长调谐、在线过程控制、光谱、波长选择等。在声光可调谐滤波器（AOTF）中，射频驱动频率施加到压电换能器（通常为铌酸锂）上，产生声波。该声波耦合到声光材料（例如二氧化碲（TeO2））中。由此形成衍射光栅，晶体的折射率随驱动频率变化。当相干光束穿过晶体时，只有窄带频率的光才能满足相位匹配条件，并以与未衍射光束不同的角度射出晶体。晶体几何形状对于获得所需的性能至关重要。

大多数高端声光器件都是按规格定制的，G&H 是领先的专业制造商，提供覆盖紫外到中红外波段、带宽小于 1 nm 的各种声光可调谐滤波器，具有通光孔径大、频率范围宽、射频驱动功率低和衍射效率高等优点。G&H 的声光可调谐系统包括电子控制装置、可配置驱动器（以提高操作灵活性）和反馈稳定系统（以在任何环境条件下保持波长稳定性）。 G&H 还采用了专利旁瓣抑制技术来提高光谱纯度，可按要求提供光纤耦合的AOTF器件。

至关重要的是，G&H是唯一一家能够自主生长高品质二氧化碲（TeO2）晶体的光学系统开发商。这有助于保持产品的一致性和可靠性，从而生产出更稳定、更可重复的声光可调谐滤波器（AOTF）产品。我们位于美国的工厂（符合ITAR规定）具备晶体生长、抛光和制造能力，确保了我们始终保持行业领先的标准。新特光电是英国G&H在中国的授权官方合作伙伴，负责G&H所有的声光器件和电光器件在中国的技术选型、项目实施与全生命周期服务，并提供整套器件集成解决方案，为您提供一站式的产品应用与技术服务！

注：如需详细规格参数资料，或有其他要求，请联系武汉新特光电。

下一代共聚焦显微镜的驱动力

对于OEM客户和终端用户而言，共聚焦显微镜的发展方向反馈表明，多功能性是一项关键需求。市场对单个系统内可调谐波长范围更广的需求日益增长，这不仅能提供更大的灵活性，还能带来更高的性价比。G&H已提供可覆盖400-2400 nm波长范围的单一光源（而非通常所需的三个滤光片），并且正在进一步提升驱动器的灵活性。

温度效应的管理是另一个需要进一步创新的领域。声光可调谐滤波器（AOTF）对温度变化非常敏感。为了克服这一问题，G&H驱动器设计采用了一种芯片，该芯片能够维持温度，然后通过反馈系统调节输出以保持其恒定，这一过程称为波长锁定。该集成系统还包含有关晶体结构、序列号等信息的可访问信息。

为了最大限度地发挥声光可调谐滤波器（AOTF）系统的潜力及其对用户的益处，G&H 在显微镜系统制造商设计下一代显微镜的初期阶段就与其展开合作。这种合作方式使制造商能够提升其显微镜和超连续谱光源的性能。

总而言之，经验表明，采用渐进式而非革命性的方法来制造和集成更有利于卓越的声光可调谐滤波器（AOTF）和驱动系统。G&H 与显微镜行业紧密合作，不断改进 AOTF 技术，以跟上生命科学和生物光子学应用领域快速发展的步伐。