声光器件克服了共聚焦显微镜的局限性

共聚焦显微镜和多光子显微镜常用于提供体外或体内组织样本的三维分辨图像，而无需进行物理切片。但在成像深度、分辨率和速度方面，这些技术也存在固有的权衡取舍。近年来，将声光元件和其他光子元件集成到显微镜中的应用正在逐步解决这些性能限制，为生命科学研究开辟新的机遇。

小鼠海马体中的位置细胞(青色)及其局部中间神经元回路(深蓝色) 。图片由哥伦比亚大学祖克曼研究所洛森齐实验室的特里斯坦·盖勒提供。

在共聚焦显微镜中，连续激光被聚焦到含有荧光染料或荧光蛋白的组织样本内部，形成一个微米级的细小激光束腰。由此产生的荧光穿过显微镜物镜，然后聚焦到位于高增益光电探测器前方的针孔光阑上。该共聚焦光阑会阻挡所有并非源自激光束腰xyz方向的光。通过扫描光束腰和/或移动样本，可以获取水平或垂直方向的图像切片，甚至整个图像立方体，并捕获多个深度的荧光信号。

多光子显微镜是一种相关技术，它使用高数值孔径光学系统聚焦超快激光。激光波长设置为激发目标荧光团所需波长的两倍。在激光束腰处，且仅在激光束腰处，聚焦峰值强度超过双光子激发阈值。这提供了固有的三维分辨率，并且无需使用损耗较大的共聚焦光阑。如今，基于仅在激光束腰处发生的非线性光学效应的多光子显微镜技术衍生出了许多变体。

传统方法的局限性

共聚焦和多光子应用常常受到成像实际权衡的负面影响，例如在捕捉代谢过程所需的帧速率下对组织深层进行成像的能力。简而言之，速度可能受限于激光束腰相对于样品的扫描速度(反之亦然)。传统上，激光强度调制也存在局限性，例如光栅扫描过程中消隐所需的调制。

同时，分辨率可能受到显微镜光学系统引起的光学像差的影响，或者更隐蔽地受到样品组织本身的光学特性的影响，而样品组织本身的光学特性也可能是不均匀的。幸运的是，有源光子元件的创新应用正在帮助解决这些局限性。在共聚焦显微镜中，光束通常在xy平面内进行光栅扫描，通常使用一对反射镜(分别对应x轴和y轴)，每个反射镜都安装在一个振镜扫描线圈上。实现这种方法最快的方式称为共振扫描，即驱动振镜高速往复共振(振荡)。然而，这种方法存在一些局限性，包括运动的非线性，其运动在第一近似下呈正弦曲线。理想情况下，光束应以恒定速度扫描以获得均匀的像素强度。近年来，共聚焦显微镜和多光子显微镜的研发者和用户尝试使用声光偏转器AOD代替振镜来扫描激光，从而避免这些速度和非线性限制。

在声光配置中，声波被施加到某种光学透射玻璃或晶体上，光束穿过该材料。对于可见光应用，声波处于射频范围。这会引起材料的光弹性形变，从而导致光学特性(包括折射率)的周期性调制。

声光偏转器AOD正是利用这种效应作为透射式衍射光栅。如下图所示，超过90%的入射光束会发生一级布拉格衍射，其偏转角由射频和其他固定因素决定。因此，扫描射频即可扫描输出角。与振镜相比，这种方法扫描速度更快，因为响应时间仅受限于射频波穿过有源晶体孔径所需的几纳秒甚至更短的时间。这种高速特性有利于捕捉细胞动力学或神经活动。

在声光偏转器AOD中，压电换能器在材料中形成布拉格光栅。光阑只允许衍射光束通过。图片由G&H公司提供。

最近发表的一项研究概述了一项利用配备声光偏转器AOD的多光子显微镜进行xy扫描的研究。该研究揭示了神经科学领域的重要新见解，这得益于AOD扫描提供的高速和高分辨率。具体而言，哥伦比亚大学Attila Losonczy教授的研究团队首次构建了小鼠海马深处中间神经元活动的三维图谱。他们利用AOD扫描多光子显微镜，以高时空分辨率实时对海马中的钙活动进行三维成像，从而观察到了这一现象。

所使用的显微镜是Femtonics公司的FEMTO3D Atlas，它实际上使用了四个AOD——两个用于x轴，两个用于y轴——可以执行各种三维感兴趣区域扫描模式，用于快速测量神经元活动和进行光刺激。这项研究颠覆了传统观念，揭示了所谓的“位置细胞”(即编码位置记忆信息的神经元)如何出人意料地与兴奋性神经元网络进行交流。

光束控制

声光效应已被证明也具有益处，例如可以通过创建一种名为声光可调滤波器AOTF的截然不同的光子元件来实现。该器件可用作动态(用户可调谐)带通滤波器。AOTF使用双折射材料，这是一种折射率取决于入射光束偏振的晶体材料。与声光偏转器AOD类似，粘合在晶体侧面的射频致动器会产生声波，从而调制晶体材料的折射率。同样，该AOD的配置是将大部分(>90%)入射光衍射成一级偏转光束，并通过孔径离开器件。但是，由于使用了双折射材料和不同的内部几何结构，AOTF由于相位匹配现象，可以选择性地仅偏转一个波长。最终得到的是一个可调谐器件，通过改变射频频率，可以改变满足相位匹配条件的波长。如果晶体切割和对准正确，改变射频不会改变衍射光(现在经过波长滤波)离开器件的角度。因此，声光可调滤波器AOTF是一种透射光学器件，可用作波长可调的窄带通滤波器。

声光可调滤波器可用作可调谐带通滤波器，其峰值透射波长取决于所施加的射频功率的频率。图片由G&H公司提供。

现在看来，在基于激光的技术中使用波长可调谐器件似乎有些不合常理。但实际上，声光可调滤波器AOTF可以通过三种不同的方式提高共聚焦显微镜的成像速度。如今，许多显微镜都配置了来自多线激光器或多激光引擎的多种激光波长。首先，AOTF可用于快速切换激发波长，也可用于成像端快速切换发射波长。这使得分析样品中的多种成分成为可能。

实验中通常涉及含有多种荧光团的样品，其中样品的发射光通过二向色滤光片、截止滤光片和带通滤光片分别导入不同的相机，或者通过滤光轮导入单个相机。在第二个例子中，AOTF允许使用单个相机进行用户可控的动态波长调谐，同样只需纳秒级的调节时间。

AOTF在共聚焦显微镜系统中的第三种用途是快速控制激光功率。具体来说，通过改变射频功率，用户可以控制器件的整体衍射功率，从而控制入射激光衍射到一级衍射的光量以及声光可调滤波器AOTF的出射光孔径。(声光偏转器AOD也常用于快速功率调制，同样是通过改变射频功率来实现的。)

包括AOD和AOTF在内的声光器件的性能高度依赖于光学晶体元件的质量以及射频电源的质量。这些因素会影响所有声光器件的最大透射率和透射波前质量，以及AOTF的带外消光等因素。反过来，这些参数会影响显微镜的性能，例如扫描速度和图像信噪比，尤其是在同一台显微镜中使用两个或多个器件时。因此，制造商非常重视垂直整合——即自行生长晶体。

反射式自适应光学技术

神经科学家正日益致力于对厚度约为1mm的小鼠大脑皮层，甚至控制感觉知觉和认知能力的新皮层进行成像。然而，由于传统光机械在z轴(图像深度)扫描方面的局限性，共聚焦显微镜的速度和分辨率都受到影响，尤其是在拍摄更深层图像时。

动态扫描或步进z轴通常通过物理移动样品或物镜来实现，这限制了扫描速度。如果显微镜用户想要拍摄样品中倾斜或不平整的平面，这种移动样品或物镜的需求可能会成为一个主要问题。此外，随着显微镜用于对更深层组织进行成像，由组织特性和显微镜自身特性引起的像差会导致分辨率降低和图像模糊。

一种校正深层图像像差的方法是借鉴天文学中一个成熟的概念，即使用可变形反射镜作为自适应光学元件。在天文学中，大气像差会影响地面望远镜的分辨率。最新的望远镜采用自适应反射镜。在这种结构中，机械致动器可以局部弯曲主镜，从而优化激光导星的成像。激光导星是由激光激发大气层上层自然存在的微量钠离子而产生的点光源。显微镜用户越来越多地使用嵌入组织中的微型荧光珠，在三维成像中提供类似的反馈。在显微镜领域，正如在天文学领域一样，可变形反射镜可以为像差校正提供动态解决方案。

如下图所示，专为此类应用设计的小型商用反射镜基于连续反射面，并通过磁性致动器进行变形。重要的是，它们具有较大的行程。这意味着这些自适应光学系统不仅可以校正较大的球面像差，还可以改变景深，实现随机访问，同时保持物镜与观测物体之间的距离恒定。

大行程自适应镜利用微型磁性致动器实现镜面形状的动态控制。图片由ALPAO提供。

下图显示了使用这些自适应光学技术获得的一组分辨率良好的深层组织图像。

自适应反射镜和反扫描双光子导星可提供活体斑马鱼大脑的双色共聚焦图像(左)。图像质量随深度增加而下降(中)。但即使在200µm深度，使用自适应光学技术仍有助于保持高分辨率(右)。图片由Kai Wang/Betzig实验室/Janelia Farm/HHMI 提供。

透射式自适应光学器件

虽然自适应反射镜具有极高的反射率，从而带来高效率，但将其应用于显微镜的一个缺点是，必须对光路进行专门修改(折叠)以适应光学器件。另一种用于动态波前校正的自适应光学方法是使用一种称为可变形相位板的透射式器件，从而避免了这种复杂性。这种独特的波形调制器由德国弗莱堡的Phaseform GmbH公司近期开发。

可变形相位板类似于一种自适应液体透镜，其形状细节(或“形状”)可在计算机控制下实时修改。如下图所示，可变形相位板由一个紧凑的密封液体填充腔组成，其一侧是柔性聚合物膜，另一侧是刚性透明玻璃基板。玻璃基板上排列着一系列可单独寻址的透明电极，覆盖了清晰的瞳孔区域。柔性膜由微加工的间隔件支撑。膜和基板之间的空间填充有高折射率液体。当对电极施加电压信号时，导电膜会被拉向基底。这种驱动力会使液体发生位移，并改变穿过液体的折射光的有效光程。

可变形相位板的示意性横截面图，展示了其作为自适应透镜的工作原理。图片由 Phaseform GmbH 公司提供。

由于可变形相位板采用超薄设计，该器件几乎不产生色散，并且可以堆叠多个器件。这使其在从生命科学显微镜到增强现实/虚拟现实等各个领域都有应用。声光技术可以提供一种快速聚焦解决方案，这要归功于一种名为声光透镜的器件，从而解决速度和深度方面的问题。

声光透镜的概念已经存在了20多年，但早期的声光透镜存在明显的缺陷，尤其是在连续激光激发方面。虽然早期的声光透镜能够利用脉冲激光器(例如在多光子显微镜中)实现快速z轴扫描和随机xyz采样，但声光透镜本身会产生球面像差问题，从而限制了对更深层组织的研究分辨率。 伦敦大学学院和其他机构的最新研究成果在实现动态声光球面透镜方面取得了重要进展，这种透镜可以校正像差、调节整体焦距，并能与连续波激光器配合使用。下图以简单的方式展示了这些透镜的工作原理。一对大孔径AOD采用反向传播的频率啁啾射频波形进行操作。

两个声光偏转器AOD通过反向传播的啁啾射频波形组合成一个单轴(柱面透镜)。四个声光偏转器AOD组合起来可以构成一个球面透镜。图片由Angus Silver Lab/UC London提供。

在伦敦大学学院的实验装置中，研究人员使用了G&H的声光偏转器AOD，并利用一套基于高速现场可编程门阵列(FPGA)的自主实验室控制系统来驱动它们。这套系统能够产生一系列精确的非线性驱动频率，用于塑造光波前。几年前，这些研究人员已经利用这种方法演示了光束在横向和轴向上的连续线扫描，该方法能够捕捉稀疏分布的脑活动。最近研究人员证明，两个声光透镜(包含四个声光偏转器AOD)可以组合并以这种方式运行，从而充当校正球面透镜，这有望应用于荧光显微镜以外的领域，例如眼科。

神经科学领域的重要应用正在不断提升3D显微镜技术的性能。幸运的是，光子学公司和终端用户的创新思维正在提供创新解决方案，这些方案有望成功实现速度和成像深度方面所需的性能提升。例如，在神经科学领域，在你阅读这句话的这段时间里，你的大脑中已经发生了一系列复杂精妙的电化学反应。通过实时成像小鼠大脑中类似的活动，荧光显微镜有望揭示大脑运作的奥秘。

作者简介

Lars Sandström是G&H生命科学副总裁，G&H是一家光子工程公司，为众多客户系统提供差异化的组件和子系统。他在光子学仪器领域拥有超过 30 年的经验，包括激光器和光学器件。